Posted on: 13 lipca, 2021 Posted by: admin Comments: 0

Monometyloamina może być stosowana przez niemetylotrofy jako jedyne źródło azotu, ale nie jako źródło węgla; jednak niewiele wiadomo na temat zaangażowanych genów i enzymów. Ostatnio rozwiązano szlak γ-glutamylometyloamid/N-metyloglutaminian do wykorzystania monometyloaminy przez metylotrofy. Zidentyfikowaliśmy geny kodujące kluczowe enzymy tego szlaku u niemetylotrofów (np. Agrobacterium tumefaciens) i wykazaliśmy, że szlak ten jest również zaangażowany w wykorzystanie monometyloaminy jako źródła azotu przez niemetylotrofy.

Monometyloamina (MMA) (CH3NH2) jest wszechobecna w środowisku i jest uwalniana podczas rozkładu wielu związków zawierających azot (1, 2, 6). Bakterie mogą wykorzystywać MMA jako jedyne źródło węgla (C) i/lub jako jedyne źródło azotu (N) (1). W przypadku bakterii metylotroficznych, które wykorzystują MMA jako źródło zarówno C, jak i N, wyjaśniono różne szlaki, w tym szlak dehydrogenazy MMA i szlak oksydazy MMA oraz dodatkowe szlaki obejmujące metylowany glutaminian, tj. γ-glutamylometyloamid (GMA) i N-metyloglutaminian (NMG) (1). Geny zaangażowane w szlak utylizacji MMA za pośrednictwem GMA/NMG, w tym syntetazę GMA (gmas), „syntazę NMG” (mgsABC) i dehydrogenazę NMG (mgdABCD), zostały niedawno zidentyfikowane w metylotrofie Methyloversatilis universalis (ryc. 1 A). (11). Chociaż MMA może służyć jako jedyne źródło N, ale nie jako źródło C dla wielu niemetylotrofów (3, 5), związane z tym mechanizmy są niejasne. Poszukiwanie klastrów genów GMA/NMG w bazach danych sekwencji genomu drobnoustrojów wykazało, że podobne klastry występują u wielu niemetylotrofów, w tym Agrobacterium tumefaciens C58, Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841, Mesorhizobium loti MAFF303099 i Ruegeria pomeroyi DSS-3. Przetestowaliśmy hipotezę, że szlak wykorzystania MMA, w którym pośredniczy GMA/NMG, jest również zaangażowany w metabolizm MMA jako jedynego źródła N przez organizmy niemetylotroficzne.

Identyfikacja klastrów genów zaangażowanych w metabolizm MMA poprzez szlak GMA/NMG u niemetylotrofów.

Zidentyfikowano klaster ośmiu genów, który koduje trzy kluczowe enzymy zaangażowane w szlak GMA/NMG utleniania MMA u metylotrofów . Ogólną reakcją utleniania MMA u metylotrofów zawierających ten szlak jest konwersja MMA do formaldehydu i amonu (CH3NH2 → HCHO + NH4+), które są używane odpowiednio jako źródło C i energii oraz jako źródło N . Poszukiwania podobnych klastrów genów kodujących szlak GMA/NMG w innych mikroorganizmach przeprowadzono przy użyciu narzędzia do zintegrowanego genomu drobnoustrojów. Podobne klastry genów są obecne w wielu metylotrofach, ale są również obecne u niemetylotrofów, takich jak Agrobacterium tumefaciens . Dlatego enzymy kodowane przez ten klaster genów mogą być wykorzystywane przez niemetylotrofy do metabolizowania MMA jako jedynego źródła N. Jeśli tak, amon uwolniony z utleniania MMA służyłby jako źródło N. Wytworzony formaldehyd jest toksyczny i wymaga detoksykacji. Rzeczywiście, gen deformylazy formylotetrahydrofolianowej (purU) znajduje się bezpośrednio za tym skupieniem genów  tumefaciens, a gen fold (kodujący dehydrogenazę/cyklohydrolazę metylenotetrahydrofolianową) jest również obecny w genomie. Dlatego jest prawdopodobne, że formaldehyd uwolniony z tego szlaku u niemetylotrofów jest przekształcany do mrówczanu przez 5,10-metylenotetrahydrofolian, 5,10-metylenotetrahydrofolian i 10-formylotetrahydrofolian . Mrówczan może dalej być utleniony do dwutlenku węgla, a geny kodujące dehydrogenazę mrówczanową są obecne w genomie A. tumefaciens. Homolog gmas (kodujący syntetazę GMA) znaleziony w tych niemetylotrofach jest opisany jako domniemana syntetaza glutaminowa; jednakże, wielokrotne dopasowania sekwencji syntetaz glutaminowych i scharakteryzowane syntetazy GMA, jak pokazano prawdopodobnie będą to syntetazy GMA. Skupiają się ze scharakteryzowanymi syntetazami GMA z metylotrofów i nie mają kluczowych reszt dla wiązania amoniaku, ale zawierają konserwatywne domeny dla wiązania ATP i glutaminianu, podobnie jak syntetazy glutaminowe. Ponadto brakuje reszty tyrozynowej , która jest powszechnie spotykana w syntetazach glutaminowych typu I i która jest poddawana adenylowaniu. Interesujące jest to, że w dwóch przypadkach (R. leguminosarum bv. viciae 3841 i Burkholderia phymatum STM815) ten klaster genów jest kodowany na plazmidzie, co wskazuje na możliwość horyzontalnego transferu genów tego szlaku metabolicznego w bakteriach. Ponieważ genetyka metabolizmu MMA u niemetylotrofów nie została ustalona, ​​postawiliśmy hipotezę, że geny w tej grupie są zaangażowane w wykorzystanie MMA jako jedynego źródła N przez niemetylotrofy, takie jak A. tumefaciens.

Monoetyloamina może być stosowany jako jedyne źródło azotu dla Agrobacterium tumefaciens.

Najpierw przetestowaliśmy, czy Monoetyloamina może wspierać wzrost tych bakterii jako jedyne źródło N, ponieważ nie zostało to wcześniej udokumentowane. Zastosowaną pożywką hodowlaną była pożywka wolna od N firmy Kanvinde i Sastry (10) dla A. tumefaciens C58, pożywka minimalna od Brown i Dilworth (4) dla R. leguminosarum bv. viciae 3841 i M. loti MAFF303099 oraz zmodyfikowaną, niezawierającą amonu pożywkę z mineralnymi solami morskimi dla Ruegeria pomeroyi DSS-3 (8). We wszystkich przypadkach jako źródło C zastosowano glukozę (5 g l-1), a jako jedyne źródło azotu dodano amon lub MMA, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Kontrolę dla każdego doświadczenia hodowlanego ustawiono bez dodawania związków N, aby uniknąć obecności zanieczyszczającego N w chemikaliach stosowanych do wytwarzania pożywek. Wszystkie eksperymenty wzrostu przeprowadzono w 30°C z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Rejestrowano wartości gęstości optycznej przy 540 nm (OD540).

Wszystkie cztery testowane szczepy były w stanie wykorzystać MMA jako jedyne źródło N (ryc. 2 A; patrz także ryc. S3 w materiale uzupełniającym). Eksperymenty kontrolne założone bez dodatku związków N nie dały żadnego wzrostu dla testowanych bakterii. Ponadto wykluczono możliwość, że MMA jest jedynym źródłem C, ponieważ samo MMA nie wspierało wzrostu żadnej z tych czterech bakterii (dane nie pokazane). Ponadto ani A. tumefaciens ani M. loti nie były w stanie użyć metanolu (10 mM) lub mrówczanu (10 mM) jako jedynego źródła węgla (dane nie pokazane). Następnie analizowano wewnątrzkomórkową pulę aminokwasów w celu zbadania, czy GMA lub NMG są zaangażowane w metabolizm MMA u tych niemetylotrofów. Analizy z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej, a następnie barwienia ninhydryną przeprowadzono w Alta Biosciences (Birmingham, Wielka Brytania). GMA wykryto w A. tumefaciens i M. loti, gdy były hodowane na MMA, ale nie, gdy były hodowane na amonie jako jedynym źródle N (patrz Rys. S4 w materiale uzupełniającym), podczas gdy NMG wykryto w Ruegeria pomeroyi, gdy hodowano na MMA, co wskazuje na znaczenie GMA/NMG w wykorzystaniu MMA u tych niemetylotrofów. Przyczyna akumulacji GMA lub NMG nie jest dobrze poznana, ale prawdopodobnie jest związana ze stanem wzrostu, jak wykazano wcześniej w badaniu z wykorzystaniem Pseudomonas sp. MA, gdzie GMA akumulowało się w warunkach niskiej zawartości tlenu, podczas gdy w warunkach wysokiej zawartości tlenu, MMA zostało przekształcone głównie w NMG (9).

Mutacja mgdC i mgsC, ale nie mutacja gmas, znosi metabolizm Monoetyloamina przez Agrobacterium tumefaciens.

Aby określić, czy ten klaster genów jest niezbędny dla metabolizmu MMA u A. tumefaciens, skonstruowaliśmy trzy mutanty, tj. mgdC::gm, mgsC::gm i gmas::gm, poprzez mutagenezę z wymianą markerów przy użyciu wektora samobójczego pK18mobsacB ( 13). W każdym przypadku regiony powyżej i poniżej (~500 pz) celu amplifikowano metodą PCR (przy użyciu starterów wymienionych w tabeli S1 w materiale uzupełniającym) i wklonowano do pK18mobsacB. Następnie pomiędzy te regiony wstawiono kasetę genową gentamycyny z p34S-Gm (7). Powstałe plazmidy poddano następnie elektroporacji do A. tumefaciens. Pojedyncze mutanty rekombinacji homologicznej wyselekcjonowano na płytkach LB (bulion lizogeniczny) z kanamycyną (50 μg ml-1). Kolonie z tych płytek hodowano następnie przez 24 godziny w płynnej pożywce LB i wysiano w różnych rozcieńczeniach (10-2 do 10-4) na płytki LB zawierające 10% (wag./obj.) sacharozy. Powstałe kolonie wrażliwe na kanamycynę przeszukiwano następnie pod kątem podwójnej homologicznej mutacji metodą PCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na obszary poza regionami powyżej i poniżej. Mutacje genów potwierdzono przez diagnostyczną PCR (patrz Tabela S1 w materiale uzupełniającym), a następnie przez sekwencjonowanie DNA. Mutanty sprawdzano przy użyciu pożywki Kanvinde i Sastry (10) pod kątem ich zdolności do wykorzystania MMA jako jedynego źródła N.

Mutanty mgdC i mgsC utraciły zdolność do wykorzystywania MMA jako jedynego źródła N (ryc. 2B), chociaż normalnie rosły przy użyciu amonu jako jedynego źródła N. W przeciwieństwie do tego mutant gmas może nadal rosnąć na MMA jako źródle N; jednak tempo wzrostu tego mutanta na MMA (0,024 h-1) było znacznie zmniejszone w porównaniu z tempem wzrostu szczepu typu dzikiego (0,043 h-1) (ryc. 2A). Dlatego skonstruowano czwartego mutanta (mgsC_gmas::gm), aby jednocześnie mutować gmas i jeden z genów kodujących „syntazę NMG”. Mutant ten nie mógł już rosnąć na Monoetyloamina jako jedynym źródle N (ryc. 2B). Nasze wyniki wskazują, że niemetylotrofy, takie jak A. tumefaciens, mogą wykorzystywać MMA jako jedyne źródło N poprzez szlak pośredniczony przez GMA/NMG, jak wykazano u niektórych metylotrofów. Geny mgdABCD i mgsABC wydają się być niezbędne u A. tumefaciens, a mutacje przedstawicieli tych klastrów genów całkowicie zniosły jego zdolność do wykorzystywania MMA. Obecność syntetazy GMA w tej bakterii jest ważna, ale nie niezbędna, ponieważ mutacja gmas spowodowała znacznie wolniejszy wzrost tej bakterii na MMA. Jest prawdopodobne, że „syntaza NMG” w A. tumefaciens (kodowana przez mgsABC) może wykorzystywać jako substrat zarówno GMA, jak i MMA, jak pokazano na ryc. 1B. W rzeczywistości wykazano, że oczyszczona „syntaza NMG” jest specyficzna dla glutaminianu, ale nie dla MMA i że wiele amin może zastąpić MMA (12). Szlak wychwytywania MMA, w którym pośredniczy GMA/NMG, jako źródło N, prawdopodobnie jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie ze względu na możliwość horyzontalnego transferu genów plazmidów kodujących ten szlak. Wcześniejsze badania wykazały, że różne rodzaje bakterii mogą wykorzystywać Monoetyloamina jako jedyne źródło N (3,5), a powszechne występowanie tej cechy fizjologicznej sugeruje, że MMA może być ważnym źródłem N w naturalnych siedliskach. Zdolność do stosowania organicznych związków azotu, takich jak MMA, przyniosłaby pewną korzyść tym mikroorganizmom, biorąc pod uwagę, że wiele środowisk jest często ograniczanych przez dostępność azotu nieorganicznego. Jednak pozostaje niejasne, czy szlak pośredniczony przez GMA/NMG jest jedynym sposobem pozyskiwania N z Monoetyloamina przez osoby niemetylotroficzne, a kwestia ta z pewnością wymaga dalszych badań.

FIGURA. 1. (A) Organizacja genów dehydrogenazy NMG (mgdABCD), syntetazy GMA (gmas) i „syntazy NMG” (mgsABC) u reprezentatywnych metylotrofów i niemetylotrofów. purU, formylotetrahydrofolianowa deformylaza. (B) Proponowany szlak metabolizmu MMA za pośrednictwem GMA i NMG w bakteriach. Specyficzność substratowa „syntazy NMG” nie jest dobrze ustalona (pokazana liniami przerywanymi) i proponuje się, aby jako substrat dla tego enzymu można było stosować zarówno MMA, jak i GMA. MMA, monometyloamina; GMA, y-glutamylometyloamid; NMG, N-metyloglutaminian; Glu, glutaminian.

FIGURA. 2. (A) Reprezentatywne krzywe wzrostu dzikiego A. tumefaciens (linie kropkowane) i mutanta gmas::gm (linie ciągłe) hodowanego z amonem (kwadraty) i MMA (diamenty) jako jedynym źródłem azotu lub bez dodatku azot (kontrole wskazano jako kółka). Pokazano średnie i odchylenia standardowe wyników z trzech powtórzonych eksperymentów. Zauważ, że oś y nie jest prezentowana jako skala logarytmiczna. (B) Reprezentatywne krzywe wzrostu mutantów mgdC::gm, mgsC::gm i mgsC_gmas::gm A. tumefaciens hodowanych z amonem (odpowiednio wypełnione, puste i zacieniowane kwadraty) i MMA (wypełnione, puste i zacieniowane) romby) jako jedyne źródło azotu lub bez dodatku azotu (kontrole oznaczono odpowiednio jako wypełnione, puste i zacienione kółka). Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe wyników z trzech powtórzonych eksperymentów. Zauważ, że oś y nie jest prezentowana jako skala logarytmiczna.